當牙(ya)周(zhou)炎(yan)、類風濕關節炎(yan)等炎(yan)癥性疾病發生(sheng)時，巨噬(shi)細(xi)胞(bao)(bao)被募集并極(ji)化為M1促炎(yan)表型。這些長(chang)期(qi)活(huo)(huo)動的M1巨噬(shi)細(xi)胞(bao)(bao)隨后產(chan)生(sheng)高水平的NO、活(huo)(huo)性氧和促炎(yan)細(xi)胞(bao)(bao)因子(zi)，導致持(chi)續的炎(yan)癥反應。促炎(yan)細(xi)胞(bao)(bao)因子(zi)可促進成骨細(xi)胞(bao)(bao)產(chan)生(sheng)RANKL的受(shou)體激活(huo)(huo)劑，導致破(po)骨細(xi)胞(bao)(bao)過(guo)度(du)形成，從而破(po)壞骨穩態。

間充質干細胞（MSCs）因具有強大的免疫調節能力而被廣泛用于各種炎癥性疾病的治療，包括牙周炎。越來越多的(de)證據表明(ming)，MSCs的(de)治(zhi)(zhi)療(liao)效(xiao)果(guo)主要歸因于其(qi)分泌的(de)旁分泌因子，其(qi)中(zhong)最(zui)關鍵的(de)是(shi)細胞(bao)外(wai)囊(nang)泡(pao)（EV），包括外(wai)泌體(ti)（EXO）、小(xiao)細胞(bao)外(wai)囊(nang)泡(pao)（sEV）。有(you)研(yan)究表明(ming)，MSC-sEV在免(mian)疫調節和誘導組(zu)織修復再生等治(zhi)(zhi)療(liao)效(xiao)果(guo)上與(yu)MSC類似，且在安全性、存(cun)儲和給藥方面(mian)比MSC療(liao)法(fa)更具優(you)勢，因此被認為是(shi)一(yi)種大有(you)潛力(li)的(de)治(zhi)(zhi)療(liao)方法(fa)。

牙髓干細胞（DPSCs）是從成人牙髓中分離出來的一種間充質干細胞，其容易獲得，且不會引起任何倫理問題。據報道，牙髓干細胞來源小細胞外囊泡（DPSC-sEV)顯示出比骨髓間充質干細胞來源小細胞外囊泡（BMSC-sEV）更強的免疫調節作用。不過，DPSC-sEV能否直接抑制巨噬細胞的炎癥反應和破骨細胞的生成，目前還是一個未知數。此外，體外培養的MSCs通常暴露在常氧（21% O2）條件下，而體內相當一部分MSCs存在于低氧環境中（2%-8%），那么在低氧條件下產生的DPSC-sEV是否能發揮更好的治療效果？

為此，中山大學附屬口腔醫院的研究團隊發現，低氧誘導的DPSC-sEV通過調節巨噬細胞極化和破骨細胞生成來改善炎癥性骨溶解。這項成果于近日發表在《Bioactive Materials》雜志上，有望為骨髓炎、牙周炎、類風濕關節炎等常見病的治療帶來一種新策略。

文獻封面截圖[1]

研究材料與方法

研究人員從SD大鼠上頜中切牙的牙髓中分離出DPSCs，并鑒定了DPSCs的成骨分化和成脂分化能力（OriCell?MSC成脂誘導分化試劑盒、OriCell?茜素紅染色液、OriCell?油紅O染色液等產品為該項研究助力）。

之后，研(yan)究人員從(cong)DPSCs中(zhong)分(fen)離出小細胞(bao)外囊(nang)泡（sEV），并開展了一系列的分(fen)析。在體內研(yan)究中(zhong)，使(shi)用了LPS誘導(dao)的小鼠顱骨(gu)炎(yan)性骨(gu)吸(xi)收模型，體外研(yan)究則使(shi)用了RAW264.7巨(ju)噬細胞(bao)。

技術路線

從(cong)DPSCs中分離出sEV，發(fa)現低(di)氧(yang)誘導了(le)DPSCs的(de)sEV釋放

Hypo-sEV誘(you)導巨噬細胞M2極化并抑制破骨(gu)細胞生成，從而改善了LPS誘(you)導的炎癥性骨(gu)吸收

通過miRNA表(biao)達譜分析等實驗(yan)，發(fa)現Hypo-sEV的治療效果是由miR-210-3p介導的

miR-210-3p通過抑制NF-κB1 p105表達(da)，來調節巨噬(shi)細胞的炎癥反應和破骨細胞的形成

研究結果

01

Hypo-sEV促進巨噬細胞M2極化并抑制破骨細胞生成

在分離出DPSCs后，研究人員經過流式分析和免疫熒光分析，確認培養的DPSCs具有MSC的間質表型，并具備多潛能分化能力。隨后，他們通過超速離心法從常氧（normoxic conditions）和低氧(hypoxic conditions)條件下培養的DPSCs上清液中分離出sEV，分別命名為Nor-sEV和Hypo-sEV。結果發現，這兩種sEV都表現出典型的EV特征，但Hypo-sEV的濃度更高，且蛋白質濃度也明顯更高。而且，通過sEV蛋白標志物分析，發現低氧明顯增加誘導了DPSCs釋放sEV。

為了比較這兩種sEV對炎癥性骨溶解的治療效果，研究人員使用了LPS誘導的小鼠炎癥性骨吸收模型。通過micro-CT掃描和組織學檢查評估，他們發現Nor-sEV對LPS誘導的骨溶解未能表現出明顯的治療效果。相反，Hypo-sEV挽救了小鼠顱骨基質的炎癥性骨溶解，即提高了BV/TV值，并減少了骨侵蝕面積（圖1）。這些結果表明，Hypo-sEV明顯改善了LPS誘導的體內炎癥性骨吸收。

圖1. Hypo-sEV在(zai)體(ti)內抑制LPS誘(you)導(dao)的炎癥性(xing)骨(gu)吸收[1]

由于巨噬細胞從M1到M2的表型轉變可促進骨修復，故研究人員接著分析了Hypo-sEV是否可促進體內的巨噬細胞M2極化。LPS導致CD68+iNOS+巨噬細胞（M1表型）數量增加，但Hypo-sEV和Nor-sEV的加入使得顱骨基質中出現了更多的CD68+Arg1+巨噬細胞（M2表型），且Hypo-sEV處理后的M1巨噬細胞更少，M2巨噬細胞更多。與Nor-sEV相比，Hypo-sEV明顯抑制IL-1β的表達，促進IL-10和Arg1的表達。由此可見，Hypo-sEV可以抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應，并誘導巨噬細胞M2極化。

炎癥性骨吸收是由破骨細胞的過度生成引起的，因此研究人員還研究了Hypo-sEV是否能抑制體內破骨細胞的生成。他們發現，Nor-sEV和Hypo-sEV都減少了LPS誘導的破骨細胞（TRAP陽性）數量，且Hypo-sEV組的破骨細胞數量低于Nor-sEV組。體外培養實驗也表明，這兩種sEV抑制了RANKL誘導的破骨細胞分化，且Hypo-sEV組的抑制效果優于Nor-sEV組。這些數據顯示，Hypo-sEV在體內和體外直接抑制了破骨細胞生成。

02Hypo-sEV通過上調miR-210-3p表達而發揮作用

為了進一步分析這背后的分子機制，研究人員決定從miRNA研究入手。他們利用新一代測序分析了Nor-sEV和Hypo-sEV的miRNA表達譜。結果發現，與Nor-sEV相比，Hypo-sEV中有45個miRNA上調，64個miRNA下調。在重點關注與巨噬細胞炎癥反應或破骨細胞分化有關的miRNA后，他們還發現Hypo-sEV中的miR-7578、miR-187-3p和miR-210-3p水平相對于Nor-sEV升高。后續分析顯示，miR-210-3p在介導Hypo-sEV的治療效果方面發揮了關鍵作用。

接著，通過對RAW264.7細胞與兩種sEV的共培養分析，進一步發現了Hypo-sEV可以將miR-210-3p遞送到巨噬細胞和破骨細胞中。miR-210-3p抑制劑提高了促炎細胞因子和iNOS的表達，同時降低了IL-10和Arg1的表達，減弱了Hypo-sEV誘導巨噬細胞M2極化的能力。此外，miR-210-3p抑制劑也部分降低了Hypo-sEV抑制破骨細胞形成的能力以及破骨細胞生成相關基因的表達（圖2）。這些結果表明，Hypo-sEV通過上調miR-210-3p表達而誘導巨噬細胞M2極化并抑制破骨細胞生成。

圖(tu)2. Hypo-sEV在體外通過遞送miR-210-3p而誘導巨噬細(xi)胞M2極化并抑制破骨細(xi)胞生成(cheng)[1]

之后，實驗轉移(yi)到小鼠模(mo)型(xing)上(shang)繼(ji)續進(jin)行(xing)。為(wei)了(le)進(jin)一(yi)步確(que)認Hypo-sEV的(de)治療(liao)效果是由miR-210-3p介導(dao)(dao)的(de)，研究(jiu)人員在(zai)LPS誘導(dao)(dao)的(de)炎癥性骨(gu)吸收模(mo)型(xing)中使用(yong)了(le)miRNA抑制劑(ji)antagomir-210-3p。結果顯示，antagomir-210-3p明顯消除了(le)Hypo-sEV的(de)治療(liao)作用(yong)。而且與對照相比，antagomir-210-3p的(de)加(jia)入導(dao)(dao)致M1型(xing)巨噬細胞增加(jia)，M2型(xing)巨噬細胞減少(shao)。這些結果證實。miR-210-3p通(tong)過誘導(dao)(dao)巨噬細胞M2極(ji)化和抑制破骨(gu)細胞生成而明顯改(gai)善了(le)LPS誘導(dao)(dao)的(de)炎癥性骨(gu)溶(rong)解。

后續的分析發現，miR-210-3p直接靶向了NF-κB1的3′UTR，而NF-κB通路的激活對巨噬細胞M1極化和破骨細胞生成至關重要。miR-210-3p通過抑制NF-κB1 p105表達來調節巨噬細胞的炎癥反應和破骨細胞的形成。

結論

圖3. miR-210-3p抑制LPS誘導的炎癥性骨吸收的示意圖[1]

這項研究表明，低氧預處理不僅(jin)誘(you)(you)導(dao)了DPSC-sEV的分泌，還增強了DPSC-sEV介導(dao)的對LPS誘(you)(you)導(dao)的骨溶解的治療效果。其中，miR-210-3p通過誘(you)(you)導(dao)巨噬細胞M2極化和(he)抑制破(po)骨細胞生成來保護骨骼。

因此，低氧誘導的DPSC-sEV和miR-210-3p的這種“一石二鳥”作用有助于開發新策略來治療炎癥性或感染性骨溶解。

文章轉載自：OriCell細胞生物學微信公眾號